Western blotting檢測試劑盒（ECL發光）

Western blotting ECL發光法檢測試劑盒

試劑盒內容：
1. 封閉試劑：30g(可配制400ml)脫脂奶粉及其他蛋白，緩沖鹽等混合物。
2. 10倍濃縮抗體稀釋液，50ml。
3. HRP標記二抗，0.1ml，效價1：2000-5000。
4. ECL顯色液，25mlA+25mlB。

試劑盒原理：
SDS-PAGE電泳后，蛋白質按照分子量大小分離，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶標記的第二抗體起反應，加入發光底物后，能讓膠片感光。zui后經顯影和定影后，可以在膠片上顯示出條帶來（抗原所在位置）。 

操作步驟：
常規電泳轉膜后，
1. 清洗轉印膜：將膜剝離下后，作好標記，一般在左上角剪一缺口。室溫用TBS-T漂洗3次每次5min,以盡量洗去轉印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結合。
2. 按5g封閉試劑加100ml雙蒸水計，配制膜封閉液，配好的膜封閉液為乳白色懸液，將漂洗過的轉印膜，封閉液內，搖床震動，室溫封閉30min。用TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次每次5min。
3. 將10×抗體稀釋液用雙蒸水稀釋成1×（10ml  10×抗體稀釋液加入90ml雙蒸水，混勻，可4℃保存三個月）。此稀釋液可作為一抗和二抗的稀釋液。
4. 用1×的抗體稀釋液稀釋抗體。根據用量以及一抗的推薦稀釋濃度來稀釋一抗。將雜交膜放入雜交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育過ye或37℃搖動孵育2h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步將膜沿電泳方向剪成條，分別作好標記，分開孵育。
5. 用TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次每次5min。
6. 用稀釋好的抗體稀釋液稀釋二抗。根據用量，按10ml抗體稀釋液加入5ulHRP標記二抗的比例，配制二抗工作液。將雜交膜放入雜交袋中，加入二抗工作液，封口， 37℃搖動孵育1h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。
7. 用TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次每次10min。
8. 配制ECL發光液：根據用量，取ECL發光液A、ECL發光液B各等量，混勻，加在膜正面，暗室顯色5分種。先傾去顯色液，再小心用紙吸去顯色液，在上面蓋一層平整的透明紙。再取出感光膠片，做好標記，輕輕的放在膜上，請小心不要錯動（余下的膠片請收好）。顯色30S到1分種，取出（直接上抬）膠片立即*浸入顯影液中1-2min，再丟入定影液中1分鐘，離開暗室，觀察結果，根據條帶強弱，可再次感光一次，并且減短或者加長感光時間（從5秒到30分鐘）以期達到理想結果。 

注意事項：
1. 請根據一抗來源選擇試劑盒。而不是標本來源來洗擇。因為二抗是與一抗反應而不是與標本反應。
2. western blotting ECL發光法操作比較煩瑣，但其敏感性較高，對于低豐度蛋白也能顯示出結果。
3.可以根據顯色結果來優化實驗反應時間。如背景過深，可延長膜封閉時間，加長zui終漂洗次數與時間。如果條帶過弱，可增加抗體濃度，延長抗體孵育時間，加長感光時間。
4. TBS-T（0.01M）配制方法：稱取NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用800ml的雙蒸水溶解，用鹽酸調PH到7.6，再加入0.5ml Tween－20，用雙蒸水 加至1000ml，混勻即可。（也可按照自己的配制習慣來配制）
如果實驗結果無條帶，可將稀釋過的一抗再作1倍，10倍，50倍稀釋，直接點到膜上（10ul），封閉，加二抗，zui后顯色，如果能顯出斑點來，則證明顯色系統沒有問題，可從蛋白裂解和一抗上面找原因；如果無法顯出，請先從顯色系統尋找原因。