Western blotting檢測(cè)試劑盒（DAB）

試劑盒組成
1. 封閉試劑：30g(可配制400ml)脫脂奶粉及其他蛋白，緩沖鹽等混合物。
2. 10倍濃縮抗體稀釋液，50ml。
3. HRP標(biāo)記二抗，0.5ml，效價(jià)1：400。
4. DAB顯色液（20×），5ml A+5ml B。

原理：

SDS-PAGE電泳后，蛋白質(zhì)按照分子量大小分離，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）后，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色以檢測(cè)電泳分離的特異性的蛋白。

操作步驟：

常規(guī)電泳轉(zhuǎn)膜后，
1) 清洗轉(zhuǎn)印膜：將膜剝離下后，作好標(biāo)記，一般在左上角剪一缺口。室溫用TBS-T漂洗3次每次5min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結(jié)合。
2) 按5g封閉試劑加100ml雙蒸水計(jì)，配制膜封閉液，配好的膜封閉液為乳白色懸液，將漂洗過(guò)的轉(zhuǎn)印膜，封閉液內(nèi)，搖床震動(dòng)，室溫封閉30min。 A@ 3) 用TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次每次5min。
3）將10×抗體稀釋液用雙蒸水稀釋成1×（10ml 10×抗體稀釋液加入90ml雙蒸水，混勻，可4℃保存三個(gè)月）。此稀釋液可作為一抗和二抗的稀釋液。
4）用1×的抗體稀釋液稀釋抗體。根據(jù)用量以及一抗的推薦稀釋濃度來(lái)稀釋一抗。將雜交膜放入雜交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育過(guò)ye或37℃搖動(dòng)孵育2h。此用過(guò)的抗體一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步將膜沿電泳方向剪成條，分別作好標(biāo)記，分開孵育。
5）用TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次每次5min。
6）用稀釋好的抗體稀釋液稀釋抗體。根據(jù)用量，按10ml抗體稀釋液加入10ulHRP標(biāo)記二抗的比例，配制二抗工作液。將雜交膜放入雜交袋中，加入加入二抗工作液，封口，4℃孵育過(guò)ye或37℃搖動(dòng)孵育2h。此用過(guò)的抗體一般可回收第二天再使用一次。
7）用TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次每次10min。
8）配制DAB顯色：根據(jù)用量，取TBS-T  4ml，加入DAB顯色液A、DAB顯色液B各200ul，混勻，加在膜正面，室溫下顯色。在目標(biāo)條帶顯出后，而且背景未出時(shí)，放入水中終止顯色。

注意事項(xiàng)：
1，   請(qǐng)根據(jù)一抗來(lái)源選擇試劑盒。括號(hào)里面代標(biāo)一抗的來(lái)源而不是標(biāo)本的來(lái)源。
2，   western blotting DAB顯色法操作簡(jiǎn)單，但其敏感性與ECL發(fā)光發(fā)有一定的差距，一般只適用于豐度較高的蛋白。
3，   可以根據(jù)顯色結(jié)果來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間。如背景過(guò)深，可延長(zhǎng)膜封閉時(shí)間，加長(zhǎng)zui終漂洗次數(shù)與時(shí)間。如果條帶過(guò)弱，可延長(zhǎng)抗體孵育時(shí)間。
4，   如果*沒(méi)有條帶，請(qǐng)檢查前期蛋白處理及實(shí)驗(yàn)過(guò)程， 如果確認(rèn)無(wú)誤，反復(fù)兩次依舊無(wú)結(jié)果，請(qǐng)換用ECL發(fā)光法顯色。
5，   TBS-T（0.01M）配制方法：稱取NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用800ml的雙蒸水溶解，用鹽酸調(diào)PH到7.6，再加入0.5mlTween－20，用雙蒸水 加至1000ml，混勻即可。（也可按照自己的配制習(xí)慣來(lái)配制）