X-gal溶液 20mg/ml BL546A

X-gal溶液 20mg/ml BL546A 現貨

IPTG/X-Gal 即用型溶液 產品編號 產品名稱 規格 BL545A IPTG 50 mg/ml 5 ml BL546A X-Gal 20 mg/ml 5 ml 產品簡介： 藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA 的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這 個編碼區中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞閱讀框，但可使少數幾個氨基酸插 入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序 列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成 具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操 縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ +細菌在誘導劑IPTG 的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到 質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒 的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產 物轉化的鈣化菌平板37℃倒置培養12-16hr后，含有插入片段重組質粒的細菌形成白色菌落， 而沒有插入片段的質粒細菌形成藍色菌落。 配制方法： 50mg/ml IPTG 5 ml：取250 mg IPTG，溶于5 ml無菌水中，過濾除菌后-20℃貯存。 20mg/ml X-Gal 5 ml：取100 mg X-gal，溶于5 ml 二甲基甲酰胺（DMF），棕色瓶中-20℃ 貯存。此試劑無需滅菌。 實驗程序： 1、轉化平板的制備： 向鋪好的含有相應抗生素的固體瓊脂平板表面加入16 µl的IPTG(50 mg/ml)、40 µl的X-gal (20 mg/ml)，使用無菌的彎頭玻璃棒將其均勻的涂開，盡量使溶解X-gal的二甲基甲酰胺揮發 干凈。 2、轉化 （1）取部分連接產物加到50-100 µl感受態細胞中（感受態細胞應剛從-70℃冰箱取出放 于冰浴上，待剛剛解凍時加入連接產物，連接產物的加入量不超過感受態細胞體積的十分之 一），輕彈混勻，冰浴30分鐘。

（2）將離心管置于精確42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴中放置2-3分鐘，其間不 要搖動離心管。 （3）向離心管中加入250-500 µl 37℃預熱的SOC或LB(不含抗生素)培養基，150rpm，37℃ 振蕩培養45分鐘。此步目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。 （4）將離心管中的菌液混勻，吸取100 μl加到含相應抗生素的SOB或LB固體瓊脂培養基 上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻涂開。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培養12-16 小時。 3、檢測 將得到的白色菌落接種 1-5 ml LB 培養基，37℃搖床振蕩培養整夜，保存菌種后提取質 粒，應用 PCR 或酶切方法鑒定插入片段是否正確。 保存條件： -20℃保存，至少一年有效。

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